No creo que estas personas saben nada sobre la elaboración de cerveza de acuerdo con sus respuestas, porque significa que la media de aire significa fermentación de alta presión significa presión de CO2.
El efecto de la presión de CO2 sobre la viabilidad comercial de las células de S. cerevisiae y sobre la tasa de producción de etanol en la levadura, se ha estudiado en cultivos discontinuos por debajo de 1,10 y 18 bar de presiones de CO2. Los resultados muestran que el efecto de la presión de CO2 en la productividad del etanol depende en gran medida de la temperatura, la glucosa y la concentración de biomasa de partida y la presión en sí. En condiciones atmosféricas de presión de CO2, la fermentación se completó después de 62 horas con un 10% (p w-1) de etanol en el caldo de fermentación. En las mismas condiciones, usando hasta 10 bar de presión de CO2, la productividad de etanol fue de aproximadamente 8% (w w-1). No se observaron producciones a una presión de CO2 de 18 bar, probablemente debido a una falla completa de la actividad enzimática. La fermentación se obtuvo a partir de una alta concentración de biomasa, sin embargo no se observó crecimiento celular durante el proceso, cuando se usaron 10 y 18 bar de presión de CO2. La adición de inositol, en la concentración del rango milimolar, influyó en gran medida en la viabilidad de las células de levadura, permitiendo la producción de etanol más rápidamente en las primeras 24 horas de fermentación. Sin embargo, después de 62 horas, la concentración final de etanol fue menor que el etanol obtenido en los medios no complementados. Finalmente, demostramos la viabilidad de utilizar un nuevo sistema de reactor presurizado, desarrollado en nuestro laboratorio, para la fermentación bajo una mayor presión de dióxido de carbono.
INTRODUCCIÓN Los biocombustibles representan una muy buena alternativa a los combustibles fósiles a corto y mediano plazo, reduciendo la dependencia del petróleo y apoyando el desarrollo de áreas rurales deprimidas. La alternativa más probable a los combustibles actualmente utilizados son las fuentes renovables, como el bioetanol y el biodiesel, pero su producción es más costosa que la refinación de petróleo, por lo que la industria de los biocombustibles aún no está plenamente desarrollada, especialmente en los países menos industrializados. Tanto el biodiesel como el bioetanol contaminan el medio ambiente menos que los combustibles fósiles y, además, provienen de fuentes renovables, es decir, cultivos anuales con un ciclo vital corto. Las limitaciones de la industria del bioetanol están representadas por la producción variable y los altos costos de distribución [1]. La destilación tradicional, comúnmente utilizada para purificar el etanol, es una técnica muy costosa. Además, la mezcla de etanol y agua forma un azeótropo, lo que aumenta aún más el costo de la purificación. Para reducir los costos de producción, se podría utilizar la extracción de etanol por dióxido de carbono supercrítico [2]. Para reducir la necesidad de energía debido al proceso de extracción de dióxido de carbono supercrítico, el desarrollo de un reactor de fermentación que funcione bajo una alta presión de CO2 podría ser útil. Como el CO2 es más soluble en solventes orgánicos que en agua, se puede extraer etanol manteniéndolo a baja concentración en solución. De esta forma, se puede reducir el efecto de inhibición del producto, haciendo también más realista un proceso de fermentación continuo, donde el sustrato se agrega continuamente y el producto se elimina. Además, la pérdida de disolvente supercrítico no sería crítica, ya que este gas se produce a partir del propio proceso de fermentación. La acción bacteriostática del CO2 y el crecimiento y metabolismo de diferentes microorganismos como S. cerevisiae se han descrito ampliamente [3,4,5,6,7]. El aumento de la presión de CO2 resultó en una disminución de la tasa de crecimiento celular y el rendimiento celular [8]. El crecimiento celular se detuvo a 280 kPa de CO2 metabólicamente
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producido durante la fermentación de etanol [9]. La fermentación hasta 2,5 bar se asoció con una muerte celular más rápida [10]. Por otro lado, la capacidad de fermentación de las células fue estimulada por la exposición a una presión parcial de CO2 aumentada de hasta 0,48 bar [11,12]. Se inhibe a 1,5 bar y permanece constante hasta 3,5 bar [10], por lo tanto, el aumento de la presión disminuye la velocidad de fermentación. El efecto de la presión sobre la viabilidad celular depende en gran medida de la naturaleza del gas utilizado para la presurización [13,14]; 6 bares de presión de CO2 causaron inactivación celular (confirmada por la reducción de las células con brotes a lo largo del tiempo) y una disminución significativa de la tasa de fermentación. Algunos autores han estudiado el efecto del CO2 hiperbárico cerca de las condiciones supercríticas (70 bar) con el propósito de aplicar la extracción de etanol supercrítico de la fermentación de caldo utilizando un valor de presión inusualmente alto en la operación del biorreactor tradicional [14]. En general, el aumento de la presión de dióxido de carbono tiene un efecto más perjudicial sobre el crecimiento de la levadura en comparación con la fermentación de la levadura. De esta manera, el problema del crecimiento detenido, típico de un proceso de fermentación a alta presión, posiblemente podría superarse. usando una alta concentración de biomasa de partida. Se informaron dos estudios interesantes sobre la respuesta transcripcional fisiológica y genómica de S. cerevisiae a la presión alta de dióxido de carbono y diferentes valores de pH, pero se requiere un análisis más detallado bajo alto CO2 antes de identificar verdaderas transcripciones de firma para el estrés por CO2 [15 ,dieciséis]. En este trabajo se ha estudiado un conjunto de diferentes condiciones de fermentación, como temperatura, presión, biomasa inicial y concentración de glucosa, en términos de concentración final de etanol mediante el uso de una cepa comercial de levadura. Con el fin de investigar la viabilidad de las células de levadura, utilizamos inositol en un medio suplementado para oponer la absorción de dióxido de carbono en la membrana plasmática. El inositol es el sustrato para la síntesis de fosfatidilinositol, un fosfolípido que permite apretar la membrana plasmática y aumentar la viabilidad a una mayor concentración de etanol [17]. Finalmente, se describió la posibilidad de utilizar un nuevo sistema de reactor presurizado, desarrollado en nuestro laboratorio, para la fermentación bajo alta presión de dióxido de carbono.
MATERIALES Y MÉTODOS Cepa de levadura y medio de crecimiento Se usó una cepa industrial de S.cerevisiae (suministrada por la división Fermentis de Lesaffre) por sus capacidades de producción de etanol altamente eficientes; se conservó a -80 ° C en 50% (v / v) de glicerol. A partir de estos cultivos, se inocularon placas de agar YPD (agar Difco 20 g L-1, 10 g de extracto de levadura L-1, 20 g de peptona L-1, 20 g de glucosa L-1) y las colonias de estas placas se cultivaron aeróbicamente en 28 ° C, 200 rpm en un medio que contiene 10 g de extracto de levadura L-1, 20 g de peptona L-1, 20 g de glucosa L-1 durante 15 h; se centrifugó y se resuspendió en 100 ml de un medio nuevo con la misma composición para obtener una densidad óptica de 0,25 a 595 nm usando el espectrofotómetro Gene Quant Pro. Los inóculos se cultivaron durante 6 ha 28 ° C, 200 rpm en una incubadora orbital en un matraz vibratorio de 250 mL para obtener aproximadamente 200 x 108 células por mL utilizadas como inóculo para experimentos discontinuos bajo presión de dióxido de carbono.
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Preparación de células para la fermentación discontinua Las células de levadura para la monitorización de la fermentación se recogieron en tubos Eppendorf de 2 ml (1,5 ml de cultivo para cada tubo) al final de la fase exponencial (6 ha 28 ° C, 200 rpm en YPD con un 0 , 25 inóculos de densidad óptica) y se lavaron dos veces en agua MilliQ. Luego se volvieron a suspender en 1,5 ml de un medio nuevo con diferente composición según el tipo de experimento.
Fermentación por lotes Los experimentos se llevaron a cabo en un reactor de acero inoxidable de 2 ml (para un total de seis reactores) a una temperatura, presión, composición del medio y biomasa de partida diferentes con una velocidad de agitación de 400 rpm. Los reactores se conectaron a una botella presurizada de 55-60 bares que contenía dióxido de carbono puro. La presión de operación se estableció mediante la manipulación de la presión del gas de entrada. La línea estaba provista de una válvula de presión de reducción para mantener la presión a un valor constante deseado. Cada reactor estaba equipado con una válvula de encendido y apagado para la presurización o despresurización independiente. Todos los reactores estaban en un baño de agua adecuado mezclado, cuya temperatura se mantuvo a un valor constante mediante termostato
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baño (una mezcla de agua y glicol); la mezcla de las muestras se aseguró mediante un agitador magnético acoplado con un agitador externo bajo el baño de agua. Todos los reactores tenían la misma presión y temperatura.
Métodos analíticos Las muestras para el análisis de la fermentación a alta presión se extrajeron de los reactores de 2 ml al final de cada experimento. La viabilidad se determinó contando el número de unidades formadoras de colonias (UFC) obtenidas después de duplicar las muestras de cultivos diluidas adecuadamente en placas en un medio compuesto por 10 g de extracto de levadura L-1, 20 g de peptona L-1. Se sembraron directamente en agar-YPD después de la liberación de presión, se contaron las colonias después de la incubación a 30 ° C durante 24 h. La concentración residual de glucosa se estimó mediante espectrofotometría con un método enzimático usando Glucosa Oxidasa y Peroxidasa de rábano picante (kit de ensayo SigmaAldrich GO). La concentración de etanol se midió mediante la inyección de 1 μL de la solución filtrada (filtros de 0,22 μm) en una cromatografía de gases Shimadzu GC-14A usando un detector TCD con las siguientes condiciones: columna Porapack QS, 1,7 mx 5 mm x 2,6 mm; temperatura del inyector 200 ° C; Temperatura de TCD 170 ° C, resistencias de corriente 150 mA, temperatura del horno 150 ° C; el gas portador era helio con un caudal de 20 ml min-1.
RESULTADOS
Efecto de la concentración de glucosa Se llevaron a cabo tres series de fermentaciones discontinuas en presencia de una concentración de glucosa de 100, 200 y 300 g L-1 en dos condiciones diferentes de presión de dióxido de carbono: 1 bar y 10 bar. Las condiciones de fermentación fueron 62 h, 32 ° C con una concentración de biomasa inicial de 70 × 108 células por ml. Bajo presión de CO2 atmosférico solo 100 y 200 g L-1 de glucosa fermentaron completamente, mientras que en 300 g L-1 muestras, el azúcar fue fermentada incompletamente por S. cerevisiae y la concentración final de etanol no superó el 10% (w w-1) ) Los datos (Figura 1) muestran claramente que cuando la presión aumentó de 1 a 10 bar, la concentración de etanol al final de la reacción se redujo, señalando el hecho de que la concentración alta de glucosa (300 g L-1) ralentizaba la velocidad de fermentación y inhibió la productividad del etanol a 10 bar. En el otro extremo, 200 g L-1 permitidos se alcanzan 7% (w w-1) de etanol a 10 bar.
0 100 200 300
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 [% EtOH] w w-1
[Glucosa] (g L-1)
10 bar 1 bar
Figura 1: concentración de etanol bajo diferentes concentraciones de glucosa inicial y presiones de CO2
Efecto de la temperatura y la concentración de biomasa Para evaluar los efectos combinados de la temperatura de fermentación y la biomasa inicial sobre la productividad de etanol (g L-1 por célula), se fermentaron medios con seis concentraciones de biomasa inicial diferentes (de 40 a 1400 × 108 células por ml) la temperatura oscila entre 30 y 38 ° C. Las condiciones de fermentación fueron 24 h, 200 g L-1, 10 bar CO2.
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La Figura 2 resume los resultados. Descubrimos que aumentar la temperatura de 30 a 36 ° C aumenta la productividad específica de etanol. A una temperatura más alta, bajo las mismas condiciones de biomasa de partida, se reduce la concentración final de etanol. Un aumento de la concentración inicial de biomasa siempre estuvo relacionado con una disminución de la productividad específica de etanol. Optimizamos la concentración de biomasa inicial a aproximadamente 200 × 108 células por ml, que corresponde a la fase exponencial tardía en el crecimiento de la levadura.
100 1000
0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24
Especulación. EtOH prod. (g L-1 x 10-8 por celda)
Concentración de inóculos (x 108 células por ml)
30 ° C 32 ° C 34 ° C 36 ° C 38 ° C
Figura 2: productividad específica de etanol a diferentes temperaturas y concentración inicial de biomasa a 10 bar de presión de CO2
Efecto de la presión Se ha examinado el efecto de la presión de hasta 10 bar de CO2 a 200 g de glucosa L-1, 36 ° C, 24 h. Estudiamos la fermentación alcohólica bajo 18 bar pero no se observó concentración de etanol al final de los procesos de fermentación en este caso. Este resultado se debe probablemente a la inactivación completa de la enzima Piruvate Decarboxilase, que está completamente inhibida a una presión cercana a 13 bar de CO2 [7].
0 10 20 30 40 50 60 70
50
100
150
200
0
2
4
6
8
10
[Residual glucose] g L-1
Tiempo (h)
[% EtOH] w w-1
Control Inositol 0,5 × 10-3 M Inositol 1 × 10-3 M
Figura 3: cinética de fermentación bajo 10 bar de presión de CO2 con diferente concentración de inositol milimolar, líneas de trazos representan la concentración de glucosa residual, concentración de etanol en línea sólida
Efecto de la concentración de inositol sobre la productividad del etanol y la viabilidad celular
Con el fin de evaluar el efecto del inositol sobre la velocidad de fermentación, llevamos a cabo un conjunto de experimentos en presencia de 0,5 y 1 mmol de L-1 de inositol. Las condiciones de fermentación fueron 10/18 bar CO2, 200 g L-1 glucosa, 36 ° C, 62 h. La adición de inositol influyó mucho en la viabilidad de las células de levadura, permitiendo
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la producción de etanol más rápidamente en las primeras 24 horas de fermentación; sin embargo, después de 62 horas, la concentración de etanol fue más baja que la de los medios no complementados (Figura 3). La tendencia simétrica de las curvas nos permite concluir que el consumo de glucosa se utilizó casi por completo para la producción de etanol. Al final de la fermentación, la concentración de etanol en los medios no complementados fue aproximadamente del 8,5% (p / p-1), un 2% más si se compara con los medios suplementados. Los resultados que se muestran en la Figura 4 indican que en presencia de células de inositol mueren menos rápidamente y mantienen una buena viabilidad durante el último paso de la fermentación. La Figura 4 también muestra que la presión de CO2 promueve la muerte de levaduras y funciona junto con el etanol para reducir la viabilidad de las levaduras.
0 10 20 30 40 50 60 70
0,01
0,1
1
10
100
1000
Viabilidad (x 108 células por ml)
Tiempo (h)
Control Inositol 0,5 × 10-3 M Inositol 1 × 10-3 M
Figura 4: Viabilidad a 10 y 18 bar de CO2 en presencia de diferentes concentraciones de inositol milimolar, las líneas del tablero representan 18 bar de presión de CO2, línea continua 10 bar de CO2 de presión
Experimento de la planta piloto Los resultados a escala de laboratorio recibieron confirmación al realizar un experimento en una planta piloto para demostrar la viabilidad de la fermentación bajo presión de dióxido de carbono a una escala mayor. El volumen de trabajo de este reactor fue de 0,5 L. Probamos la capacidad fermentativa de S.cerevisiae mediante el control de la fermentación durante 45 h con las mismas condiciones utilizadas para la planta multibatch, es decir, 10 bar CO2, 200 g L-1, 36 ° C, 400 rpm, aproximadamente 200 × 108 células por ml y sin suplemento de inositol. Como se informa en la Figura 5, encontramos que la velocidad de fermentación es mayor en el reactor piloto que en la planta multibatch, probablemente debido a una mejor mezcla en el primero.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
2
4
6
8
10
[% EtOH] w w-1
Tiempo (h)
Batch reactor Multibatch planta
Figura 5: Comparación de la fermentación entre el reactor discontinuo y la planta multibatch bajo presión de CO2
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6
CONCLUSIÓN En este trabajo hemos estudiado la fermentación de la glucosa bajo una alta presión de dióxido de carbono utilizando una cepa comercial de S. cerevisiae. Demostramos que la producción de etanol por fermentación bajo 10 bar de presión podría ser posible, mientras que no se obtuvo producción de etanol a 18 bar de presión de CO2. Las condiciones de fermentación se optimizaron cambiando la temperatura, la glucosa y la concentración de biomasa obteniendo una concentración de etanol de aproximadamente 8,5% (w w-1) en lugar de 10% (w w-1) obtenida en condiciones de presión atmosférica. Se verificó la viabilidad de usar un nuevo reactor piloto presurizado para fermentar a alta presión de dióxido de carbono. Finalmente, encontramos que el uso de inositol en los medios suplementados puede mejorar la viabilidad de las levaduras principalmente durante la última etapa de la fermentación, pero se observó un aumento en la concentración de etanol hasta las 24 h de fermentación solamente.
